DESARROLLO
DE UNA ONE-STEP RT-PCR CUANTITATIVA CUÁDRUPLEX PARA LA DETECCIÓN Y
CUANTIFICACIÓN SIMULTÁNEA DEL VIRUS DE LA HEPATITIS A, NOROVIRUS GI Y GII Y
MENGOVIRUS
El virus de la Hepatitis A (HAV) y los Norovirus
genogrupo I (NoV GI) y genogrupo II (NoV GII) son importantes agentes causantes
de enfermedades de transmisión por agua
y alimentos.
En este contexto,
se hace necesaria la disponibilidad de metodologías para una precisa detección
y cuantificación de estos virus tanto en aguas como en distintas matrices
alimentarias. En el año 2004, el Comité Europeo de Normalización (CEN) creó un
grupo de asesoramiento técnico (CEN/TC275/WG6/TAG4) para el desarrollo de
métodos estandarizados de extracción de virus a partir de distintas matrices
alimentarias y análisis por real-time RT-PCR (monoplex) para la detección
cualitativa y cuantitativa tanto de HAV como de NoV. Dichos métodos han
devenido en la actualidad como procedimientos ISO (CEN/ISO TS 15216-1; CEN/ISO
TS 15216-2). En dichos protocolos se utiliza Mengovirus como virus control para
la determinación de la eficiencia del proceso de extracción de los virus diana
a partir de las distintas matrices alimentarias y de su RNA. Además de dicho
control, se incluyen también transcritos correspondientes a cada uno de los
virus como controles externos para la determinación de la eficiencia de la
reacción de retrotranscripción. Ambos controles funcionan a modo de control de
calidad del proceso experimental y al mismo tiempo ofrecen la posibilidad de
utilizar los valores tanto de la eficiencia de extracción como de la eficiencia
de la reacción de retrotranscripción para corregir los datos crudos de
cuantificación de los virus diana y obtener de esta manera una cuantificación
más precisa de la carga vírica.
Hasta la fecha, no se han
descrito ensayos de RT-PCR cuantitativa multiplex para la detección simultánea
de HAV y NoV que incluyan controles del proceso de extracción ni controles
externos. En este estudio
se presenta un ensayo de RT-PCR cuantitativa en formato cuádruplex para la
detección y cuantificación simultánea de HAV, NoV GI y NoV GII, juntamente con
el virus Mengo, utilizado como virus control de proceso. Además de dicho
control, y de manera análoga a los protocolos monoplex desarrollados por el
CEN, también se incluyen controles externos para cada uno de los virus diana. El
ensayo cuádruplex presentado fue validado en comparación a los correspondientes
ensayos en formato monoplex desarrollados por el CEN.
Tras la optimización del ensayo cuádruplex, los
resultados obtenidos al ensayar diluciones seriadas tanto de los distintos RNAs
víricos como de plásmidos con las respectivas secuencias diana clonadas fueron
muy similares en ambos formatos monoplex y cuádruplex. La diferencia media de
Cqs entre ambos formatos fue de 0.14, 0.08 y 0.83 para HAV, NoV GI y NoV GII,
respectivamente, en el caso de los plásmidos; y de 0.90, 0.28 y 0.44, en el
caso de los RNAs víricos. En cuanto a los límites de detección obtenidos en el
ensayo cuádruplex para HAV, NoV GI y NoV GII, éstos fueron de 491, 23 y 33
copias por reacción, respectivamente. En el caso de NoV GII el límite de
detección resultó similar al del ensayo en formato monoplex, mientras que en el
caso de HAV y NoV GI los límites de detección obtenidos fueron 1-log superiores
a los de los respectivos ensayos monoplex. Para evaluar la implicación de estas
pérdidas en límite de detección teórico, se procedió a analizar muestras de
agua y marisco naturalmente contaminadas usando ambos tipos de ensayos. En
general, se observó una buena correlación entre los títulos de copias genómicas
obtenidas con ambos ensayos. En comparación con los ensayos en formato monoplex,
el ensayo cuádruplex mostró unas diferencias de título medias de 0.32 log para
HAV, 0.37 log para NoV GI y 0.51 log para NoV GII.
En definitiva, a pesar de la ligera pérdida de
sensibilidad respecto a los ensayos en formato monoplex, el ensayo cuádruplex
presentado resulta una alternativa útil a modo de screening inicial de muestras
de marisco y agua, debido a la reducción que supone tanto a nivel de tiempo
empleado para su desarrollo como a nivel de costes.